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Les systèmes de laboratoire sur puce dotés de capacités sur site offrent le potentiel d'un diagnostic rapide et précis et sont utiles dans les environnements aux ressources limitées où les équipements biomédicaux et les professionnels formés ne sont pas disponibles.Cependant, la création d'un système de test au point d'intervention qui possède simultanément toutes les fonctionnalités nécessaires pour une distribution multifonctionnelle, une libération à la demande, des performances fiables et un stockage à long terme des réactifs reste un défi majeur.Nous décrivons ici une technologie de micro-interrupteur de déplacement actionné par levier qui peut manipuler les fluides dans n'importe quelle direction, fournir une réponse précise et proportionnelle à la pression d'air appliquée et rester stable face aux mouvements et vibrations brusques.Sur la base de cette technologie, nous décrivons également le développement d'un système de réaction en chaîne par polymérase qui intègre les fonctions d'introduction, de mélange et de réaction des réactifs en un seul processus, ce qui permet d'obtenir des performances « échantillon dans réponse – sortie » pour tous les échantillons nasaux cliniques provenant de 18 patients atteints de Grippe et 18 contrôles individuels, en bonne concordance d'intensité de fluorescence avec la réaction en chaîne par polymérase standard (coefficients de Pearson > 0,9).Sur la base de cette technologie, nous décrivons également le développement d'un système de réaction en chaîne par polymérase qui intègre les fonctions d'introduction, de mélange et de réaction des réactifs en un seul processus, ce qui permet d'obtenir des performances « échantillon dans réponse – sortie » pour tous les échantillons nasaux cliniques de 18 patients. avec la grippe et 18 contrôles individuels, en bonne concordance d'intensité de fluorescence avec la réaction en chaîne par polymérase standard (coefficients de Pearson > 0,9).Основываясь on this technology, мы также описываем разработку системы полимеразной цепной реакции, которая объединяет функции введения réactifs, méthodes et réactions dans le cadre d'un processus normal, qui s'adressent à toutes les cliniques qui travaillent actuellement avec 18 patients avec Gripp et 18 autres contrôleurs, dans le cadre de mesures d'intensité de fluorescence standard (coefficients de conformité Pirsona> 0,9).Sur la base de cette technologie, nous décrivons également le développement d'un système de réaction en chaîne par polymérase qui combine les fonctions d'injection, de mélange et de réaction en un seul processus, permettant ainsi l'échantillonnage en réponse pour tous les échantillons nasaux cliniques provenant de 18 patients grippés.et 18 contrôles individuels, en bon accord avec l'intensité de fluorescence standard de la réaction en chaîne par polymérase (coefficients de Pearson > 0,9).Sur la base de cette technologie, nous décrivons également le développement d'un système de réaction en chaîne par polymérase qui intègre des fonctions d'injection, de mélange et de réaction de réactifs pour analyser tous les échantillons nasaux cliniques à partir de 18 échantillons nasaux de patients dans l'échantillon. Grippe et 18 contrôles individuels, intensité de fluorescence adaptée bien avec la réaction en chaîne par polymérase standard (coefficient de Pearson > 0,9).La plate-forme proposée garantit une automatisation fiable de l'analyse biomédicale et peut ainsi accélérer la commercialisation d'une gamme d'appareils de test au point de service.
Les maladies humaines émergentes, telles que la pandémie de COVID-19 de 2020 qui a coûté la vie à des millions de personnes, constituent une menace sérieuse pour la santé mondiale et la civilisation humaine1.Une détection précoce, rapide et précise des maladies est essentielle pour contrôler la propagation du virus et améliorer les résultats du traitement.Un écosystème de diagnostic de base basé sur des laboratoires centralisés où les échantillons de test sont envoyés aux hôpitaux ou aux cliniques de diagnostic et gérés par des professionnels, restreint actuellement l'accès à près de 5,8 milliards de personnes dans le monde, en particulier celles vivant dans des environnements aux ressources limitées.où il y a un manque d’équipements biomédicaux coûteux et de spécialistes qualifiés.cliniciens 2. Il existe donc un besoin urgent de développer un système de laboratoire sur puce peu coûteux et convivial doté d'une capacité de test au point d'intervention (POCT) qui puisse fournir aux cliniciens des informations diagnostiques en temps opportun pour prendre des décisions éclairées en matière de diagnostic. .et traitement 3.
Les directives de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) stipulent qu'un POCT idéal doit être abordable, convivial (facile à utiliser avec une formation minimale), précis (éviter les faux négatifs ou les faux positifs), rapide et fiable (offrir de bonnes propriétés de répétabilité) et livrable (capable de stockage à long terme et facilement disponible pour les utilisateurs finaux)4.Pour répondre à ces exigences, les systèmes POCT doivent offrir les fonctionnalités suivantes : un dosage polyvalent pour réduire l'intervention manuelle, une libération à la demande pour transporter les réactifs à l'échelle pour des résultats de test précis et des performances fiables pour résister aux vibrations environnementales.Actuellement, le dispositif POCT le plus largement utilisé est la bandelette à flux latéral5,6 composée de plusieurs couches de membranes poreuses de nitrocellulose qui poussent une très petite quantité d’échantillon vers l’avant, réagissant avec les réactifs pré-immobilisés par force capillaire.Bien qu'ils présentent l'avantage d'être peu coûteux, faciles à utiliser et rapides à obtenir des résultats, les dispositifs POCT basés sur des bandelettes de débit ne peuvent être utilisés que pour des tests biologiques (par exemple, tests de glycémie7,8 et tests de grossesse9,10) sans nécessiter d'analyses en plusieurs étapes.réactions (par exemple chargement de plusieurs réactifs, mélange, multiplexage).De plus, les forces motrices qui contrôlent le mouvement du fluide (c'est-à-dire les forces capillaires) n'offrent pas une bonne cohérence, en particulier entre les lots, ce qui entraîne une mauvaise reproductibilité11 et rend les bandes d'écoulement latéral principalement utiles pour une bonne détection12,13.
Les capacités de fabrication étendues à l’échelle micro et nanométrique ont créé des opportunités pour le développement de dispositifs microfluidiques POCT pour les mesures quantitatives14,15,16,17.En ajustant les propriétés de l'interface 18, 19 et la géométrie des canaux 20, 21, 22, la force capillaire et le débit de ces dispositifs peuvent être contrôlés.Cependant, leur fiabilité, en particulier pour les liquides très mouillés, reste inacceptable en raison d'imprécisions de fabrication, de défauts de matériaux et de sensibilité aux vibrations environnementales.De plus, puisqu'un flux capillaire est créé à l'interface liquide-gaz, aucun flux supplémentaire ne peut être introduit, notamment après remplissage de liquide du canal microfluidique.Par conséquent, pour une détection plus complexe, plusieurs étapes d’injection d’échantillon doivent être effectuées24,25.
Parmi les dispositifs microfluidiques, les dispositifs microfluidiques centrifuges constituent actuellement l’une des meilleures solutions pour le POCT26,27.Son mécanisme d'entraînement est avantageux dans la mesure où la force motrice peut être contrôlée en ajustant la vitesse de rotation.Cependant, l'inconvénient est que la force centrifuge est toujours dirigée vers le bord extérieur de l'appareil, ce qui rend difficile la mise en œuvre des réactions en plusieurs étapes nécessaires à des analyses plus complexes.Bien que des forces motrices supplémentaires (par exemple capillaires 28, 29 et bien d'autres 30, 31, 32, 33, 34, 35) en plus de la force centrifuge soient introduites pour un dosage multifonctionnel, un transfert de liquide imprévu peut toujours se produire car ces forces supplémentaires sont généralement des ordres. d'amplitude inférieure à la force centrifuge, ce qui les rend efficaces uniquement sur de petites plages de fonctionnement ou non disponibles sur demande avec libération de liquide.L'intégration de manipulations pneumatiques dans la microfluidique centrifuge telle que les méthodes cinétiques centrifuges 36, 37, 38, les méthodes thermopneumatiques 39 et les méthodes pneumatiques actives 40 s'est avérée être une alternative intéressante.Avec l'approche contre-fugodynamique, une cavité supplémentaire et des microcanaux de connexion sont intégrés dans le dispositif pour une action externe et interne, bien que son efficacité de pompage (de l'ordre de 75 % à 90 %) dépende fortement du nombre de cycles de pompage et de la viscosité. du liquide.Dans la méthode thermopneumatique, la membrane en latex et la chambre de transfert de fluide sont spécifiquement conçues pour sceller ou rouvrir l'entrée lorsque le volume d'air emprisonné est chauffé ou refroidi.Cependant, l'installation de chauffage/refroidissement introduit des problèmes de réponse lente et limite son utilisation dans les analyses thermosensibles (par exemple, amplification par réaction en chaîne par polymérase (PCR)).Avec une approche pneumatique active, le relâchement à la demande et le mouvement vers l'intérieur sont obtenus grâce à l'application simultanée d'une pression positive et de vitesses de rotation précisément adaptées par des moteurs à grande vitesse.Il existe d'autres approches réussies utilisant uniquement des actionneurs pneumatiques (pression positive 41, 42 ou pression négative 43) et des conceptions de vannes normalement fermées.En appliquant successivement une pression dans la chambre pneumatique, le liquide est pompé vers l'avant de manière péristaltique et la vanne normalement fermée empêche le reflux de liquide dû au péristaltisme, réalisant ainsi des opérations liquides complexes.Cependant, il n'existe actuellement qu'un nombre limité de technologies microfluidiques capables d'effectuer des opérations complexes sur les liquides dans un seul dispositif POCT, notamment la distribution multifonctionnelle, la libération à la demande, des performances fiables, le stockage à long terme, la manipulation de liquides à haute viscosité, et une fabrication rentable.Tout en même temps.L’absence d’opération fonctionnelle en plusieurs étapes peut également être l’une des raisons pour lesquelles seuls quelques produits POCT commerciaux tels que Cepheid, Binx, Visby, Cobas Liat et Rhonda ont été introduits avec succès sur le marché libre à ce jour.
Dans cet article, nous proposons un actionneur microfluidique pneumatique basé sur la technologie des micro-interrupteurs à anneau vert (FAST).FAST combine toutes les propriétés nécessaires en même temps pour une large gamme de réactifs allant du microlitre au millilitre.FAST se compose de membranes élastiques, de leviers et de blocs.Sans application de pression d'air, les membranes, leviers et blocs peuvent être hermétiquement fermés et le liquide à l'intérieur peut être stocké pendant une longue période.Lorsqu'une pression appropriée est appliquée et ajustée à la longueur du levier, le diaphragme se dilate et pousse le levier en position ouverte, permettant au fluide de passer à travers.Cela permet un dosage multifonctionnel de liquides en cascade, de manière simultanée, séquentielle ou sélective.
Nous avons développé un système PCR utilisant FAST pour générer des résultats de réponse dans les échantillons pour la détection des virus grippaux A et B (IAV et IBV).Nous avons atteint une limite inférieure de détection (LOD) de 102 copies/mL, notre test multiplex a montré une spécificité pour l'IAV et l'IBV et a permis le pathotypage du virus de la grippe.Les résultats des tests cliniques utilisant l'échantillon sur écouvillon nasal provenant de 18 patients et 18 individus en bonne santé montrent une bonne concordance de l'intensité de fluorescence avec la RT-PCR standard (coefficients de Pearson > 0,9).Les résultats des tests cliniques utilisant l'échantillon sur écouvillon nasal provenant de 18 patients et 18 individus en bonne santé montrent une bonne concordance de l'intensité de fluorescence avec la RT-PCR standard (coefficients de Pearson > 0,9).Résultats des cliniques d'utilisation du masque chez 18 patients et 18 jours pour chaque patient интенсивности флуоресценции стандартной ОТ-ПЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9).Les résultats d'essais cliniques utilisant un échantillon d'écouvillonnage nasal provenant de 18 patients et de 18 individus en bonne santé montrent un bon accord entre l'intensité de fluorescence de la RT-PCR standard (coefficients de Pearson > 0,9).0,9）。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 Résultats des cliniques de soins utilisant des masques de 18 patients et 18 jours de soins между интенсивностью флуоресценции и стандартной ОТ-ПЦР (коэффициент Пирсона > 0,9).Les résultats d'essais cliniques utilisant des échantillons sur écouvillon nasal provenant de 18 patients et 18 individus en bonne santé ont montré un bon accord entre l'intensité de fluorescence et la RT-PCR standard (coefficient de Pearson > 0,9).Le coût matériel estimé d'un dispositif FAST-POCT est d'environ 1 $ US (tableau supplémentaire 1) et peut être encore réduit en utilisant des méthodes de fabrication à grande échelle (par exemple, moulage par injection).En fait, les dispositifs POCT basés sur FAST possèdent toutes les fonctionnalités nécessaires exigées par l’OMS et sont compatibles avec les nouvelles méthodes de tests biochimiques telles que le cyclage thermique du plasma44, les tests immunologiques sans amplification45 et les tests de fonctionnalisation des nanocorps46 qui constituent l’épine dorsale des systèmes POCT.possibilité.
Sur la fig.La figure 1a montre la structure de la plateforme FAST-POCT, qui se compose de quatre chambres à liquide : une chambre de pré-stockage, une chambre de mélange, une chambre de réaction et une chambre à déchets.La clé du contrôle du débit de fluide est la conception FAST (composée de membranes élastiques, de leviers et de blocs) située dans la chambre de pré-stockage et la chambre de mélange.En tant que méthode actionnée pneumatiquement, la conception FAST offre un contrôle précis du débit de fluide, y compris une commutation fermé/ouvert, un dosage polyvalent, une libération de fluide à la demande, un fonctionnement fiable (par exemple, insensibilité aux vibrations environnementales) et un stockage à long terme.La plate-forme FAST-POCT se compose de quatre couches : une couche de support, une couche de film élastique, une couche de film plastique et une couche de couverture, comme le montre une vue agrandie sur la figure 1b (également représentée en détail sur les figures supplémentaires S1 et S2. ).Tous les canaux et chambres de transport de fluides (telles que les chambres de pré-stockage et de réaction) sont intégrés dans des substrats PLA (acide polylactique) allant de 0,2 mm (partie la plus fine) à 5 mm d'épaisseur.Le matériau du film élastique est un PDMS de 300 µm d’épaisseur qui se dilate facilement lorsque la pression de l’air est appliquée en raison de sa « fine épaisseur » et de son faible module d’élasticité (environ 2,25 MPa47).La couche de film de polyéthylène est constituée de polyéthylène téréphtalate (PET) d'une épaisseur de 100 µm pour protéger le film élastique d'une déformation excessive due à la pression de l'air.Correspondant aux chambres, la couche de substrat possède des leviers reliés à la couche de couverture (en PLA) par des charnières pour contrôler le flux de liquide.Le film élastique a été collé sur la couche de support à l'aide d'un ruban adhésif double face (ARseal 90880) et recouvert d'un film plastique.Trois couches ont été assemblées sur un substrat à l'aide d'un design à clip en T dans la couche de couverture.La pince en T a un espace entre deux pieds.Lorsque le clip a été inséré dans la rainure, les deux pieds se sont légèrement pliés, puis sont revenus à leur état d'origine et ont étroitement lié le couvercle et le support lors de leur passage à travers la rainure (Fig. S1 supplémentaire).Les quatre couches sont ensuite assemblées à l'aide de connecteurs.
Schéma schématique de la plateforme illustrant les différents compartiments fonctionnels et fonctionnalités de FAST.b Schéma agrandi de la plateforme FAST-POCT.c Photo de la plate-forme à côté d'une pièce d'un quart de dollar américain.
Le mécanisme de fonctionnement de la plate-forme FAST-POCT est illustré à la figure 2. Les composants clés sont les blocs sur la couche de base et les charnières sur la couche de couverture, ce qui entraîne une conception à interférence lorsque les quatre couches sont assemblées à l'aide d'une forme en T. .Lorsqu'aucune pression d'air n'est appliquée (fig. 2a), l'ajustement serré provoque la flexion et la déformation de la charnière, et une force d'étanchéité est appliquée à travers le levier pour presser le film élastique contre le bloc, et le liquide dans la cavité d'étanchéité est défini comme un état scellé.Il convient de noter que dans cet état, le levier est plié vers l'extérieur, comme le montre la vue latérale de la figure 2a.Lorsque de l'air est fourni (Fig. 2b), la membrane élastique se dilate vers le couvercle et pousse le levier vers le haut, ouvrant ainsi un espace entre le levier et le bloc pour permettre au fluide de s'écouler dans la chambre suivante, définie comme un état ouvert. .Après la libération de la pression d'air, le levier peut revenir à sa position d'origine et rester serré grâce à l'élasticité de la charnière.Des vidéos des mouvements du levier sont présentées dans le film supplémentaire S1.
A. Diagramme schématique et photographies une fois fermé.En l'absence de pression, le levier plaque la membrane contre le bloc, et le liquide est scellé.b En bon état.Lorsqu'une pression est appliquée, la membrane se dilate et pousse le levier vers le haut, de sorte que le canal s'ouvre et que le fluide puisse s'écouler.c Déterminer la taille caractéristique de la pression critique.Les dimensions caractéristiques incluent la longueur du levier (L), la distance entre le curseur et la charnière (l) et l'épaisseur de la saillie du levier (t).Fs est la force de compactage au point d'étranglement B. q est la charge uniformément répartie sur le levier.Tx* représente le couple développé par le levier articulé.La pression critique est la pression nécessaire pour soulever le levier et faire circuler le fluide.d Résultats théoriques et expérimentaux de la relation entre la pression critique et la taille des éléments.n = 6 expériences indépendantes ont été réalisées et les données sont présentées sous forme de ± écart type.Les données brutes sont présentées sous forme de fichiers de données brutes.
Un modèle analytique basé sur la théorie des poutres a été développé pour analyser la dépendance de la pression critique Pc à laquelle l'espace s'ouvre sur les paramètres géométriques (par exemple, L est la longueur du levier, l est la distance entre le bloc et le charnière, S est le levier. La zone de contact avec le liquide t est l'épaisseur de la saillie du levier, comme le montre la Fig. 2c).Comme détaillé dans les notes complémentaires et la figure supplémentaire S3, l'écart s'ouvre lorsque \({P}_{c}\ge \frac{2{F}_{s}l}{SL}\), où Fs est le couple \ ({T}_{x}^{\ast}(={F}_{s}l)\) pour éliminer les forces associées à un ajustement serré et provoquer la flexion de la charnière.La réponse expérimentale et le modèle analytique montrent un bon accord (Fig. 2d), montrant que la pression critique Pc augmente avec l'augmentation de t/l et la diminution de L, ce qui s'explique facilement par le modèle de poutre classique, c'est-à-dire que le couple augmente avec t/Lift. .Ainsi, notre analyse théorique montre clairement que la pression critique peut être contrôlée efficacement en ajustant la longueur du levier L et le rapport t/l, ce qui constitue une base importante pour la conception de la plateforme FAST-POCT.
La plate-forme FAST-POCT offre une distribution multifonctionnelle (illustré sur la figure 3a avec encadré et expérience), qui constitue la caractéristique la plus importante d'un POCT réussi, où les fluides peuvent s'écouler dans n'importe quelle direction et dans n'importe quel ordre (cascade, simultané, séquentiel) ou multicanal sélectif. distribution .– fonction de dosage.Sur la fig.La figure 3a(i) montre un mode de dosage en cascade dans lequel deux chambres ou plus sont mises en cascade à l'aide de blocs pour séparer les différents réactifs et d'un levier pour contrôler les états ouvert et fermé.Lorsqu'une pression est appliquée, le liquide s'écoule de la chambre supérieure vers la chambre inférieure en cascade.Il convient de noter que les chambres en cascade peuvent être remplies de produits chimiques humides ou de produits chimiques secs tels que des poudres lyophilisées.Dans l'expérience de la figure 3a (i), l'encre rouge de la chambre supérieure s'écoule avec la poudre de colorant bleu (sulfate de cuivre) dans la deuxième chambre et devient bleu foncé lorsqu'elle atteint la chambre inférieure.Il indique également la pression de contrôle du fluide pompé.De même, lorsqu'un levier est connecté à deux chambres, cela devient le mode d'injection simultanée, comme le montre la fig.3a(ii), dans lequel le liquide peut être réparti uniformément sur deux chambres ou plus lorsqu'une pression est appliquée.Puisque la pression critique dépend de la longueur du levier, la longueur du levier peut être ajustée pour obtenir un modèle d'injection séquentielle comme le montre la fig.3a(iii).Un levier long (avec pression critique Pc_long) a été connecté à la chambre B et un levier court (avec pression critique Pc_short > Pc_long) a été connecté à la chambre A. Comme la pression P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) a été appliquée, seul le liquide en rouge peut s'écouler vers la chambre B et lorsque la pression a été augmentée jusqu'à P2 (> Pc_short), le liquide bleu peut s'écouler vers la chambre A. Ce mode d'injection séquentielle s'applique à différents liquides transférés en séquence vers leurs chambres associées, ce qui est essentiel pour un POCT réussi. appareil.Un levier long (avec pression critique Pc_long) a été connecté à la chambre B et un levier court (avec pression critique Pc_short > Pc_long) a été connecté à la chambre A. Comme la pression P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) a été appliquée, seul le liquide en rouge peut s'écouler vers la chambre B et lorsque la pression a été augmentée jusqu'à P2 (> Pc_short), le liquide bleu peut s'écouler vers la chambre A. Ce mode d'injection séquentielle s'applique à différents liquides transférés en séquence vers leurs chambres associées, ce qui est essentiel pour un POCT réussi. appareil.Les lignes directrices (avec la critique de Pc_long) sont liées à la caméra B, et les réponses (avec la critique de Pc_short > Pc_long) sont liées à la caméra. A. Lors de l'application de la date P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), vous pouvez tout à fait le faire. La caméra B et la date de sortie sont disponibles pour P2 (> Pc_short), mais vous pouvez également la connecter à la caméra A. Cela se produit ensuite Il s'agit en fait d'une procédure de résolution des problèmes pour les caméras externes.Un levier long (avec pression critique Pc_long) a été connecté à la chambre B, et un levier court (avec pression critique Pc_short > Pc_long) a été connecté à la chambre A. Lorsque la pression P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) est appliquée, seul le liquide mis en évidence en rouge peut s'écouler dans la chambre B, et lorsque la pression a été augmentée jusqu'à P2 (> Pc_short), le liquide bleu peut s'écouler dans la chambre A. Ce mode d'injection séquentielle est appliqué à différents fluides transférés séquentiellement vers les chambres respectives, ce qui est critique pour un POCT réussi.appareil. La ligne droite (croisière pour la photo Pc_long) est associée à la caméra B, et la clé courte (croisement pour la photo Pc_short > Pc_long) est attachée à la caméra A.Le bras long (pression critique Pc_long) est relié à la chambre B et le bras court (pression critique Pc_short > Pc_long) est relié à la chambre A.Lors de l'installation de la caméra P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) dans la caméra B, il est possible d'obtenir une résolution complète, avant la configuration de la caméra P2 (> Pc_short) dans la caméra A. Je vais le poster sans problème.Lorsque la pression P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) est appliquée, seul le liquide rouge peut entrer dans la chambre B, et lorsque la pression est augmentée jusqu'à P2 (> Pc_short), le liquide bleu peut entrer dans la chambre A. Ce mode d'injection séquentielle convient au transfert séquentiel de divers fluides dans les chambres respectives, ce qui est essentiel au bon fonctionnement du dispositif POCT.La figure 3a (iv) montre le mode d'injection sélectif, dans lequel la chambre principale avait un levier court (avec pression critique Pc_short) et un levier long (avec pression critique Pc_long <Pc_short) qui étaient connectés respectivement à la chambre A et à la chambre B. vers un autre canal d'air connecté à la chambre B. Pour transférer le liquide vers la chambre A en premier, les pressions P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) et P2 (P2 > P1) avec P1 + P2 > Pc_short ont été appliquées à l'appareil en même temps.La figure 3a (iv) montre le mode d'injection sélectif, dans lequel la chambre principale avait un levier court (avec pression critique Pc_short) et un levier long (avec pression critique Pc_long
a Illustration d'une affectation multifonctionnelle, c'est-à-dire (i) une affectation en cascade, (ii) une affectation simultanée, (iii) une affectation séquentielle et (iv) une affectation sélective.Les courbes représentent le flux de travail et les paramètres de ces quatre modes de distribution.b Résultats des tests de stockage à long terme dans l'eau déminéralisée et l'éthanol.n = 5 expériences indépendantes ont été réalisées et les données sont affichées sous la forme ± sd c.Démonstrations de tests de stabilité lorsque le dispositif FAST et le dispositif à valve capillaire (CV) étaient dans des états (i) statique et (ii) vibrant.(iii) Volume en fonction du temps pour les appareils FAST et CV à différentes fréquences angulaires.d Publication des résultats d'essais sur demande pour (i) le dispositif FAST et (ii) le dispositif CV.(iii) Relation entre le volume et le temps pour les appareils FAST et CV utilisant le mode de pression intermittente.Toutes les barres d'échelle, 1 cm.Les données brutes sont fournies sous forme de fichiers de données brutes.
Le stockage à long terme des réactifs est une autre caractéristique importante d’un dispositif POCT performant qui permettra au personnel non formé de manipuler plusieurs réactifs.Alors que de nombreuses technologies ont montré leur potentiel de stockage à long terme (par exemple, 35 microdistributeurs, 48 blisters et 49 stick packs), un compartiment de réception dédié est nécessaire pour accueillir l'emballage, ce qui augmente le coût et la complexité ;de plus, ces mécanismes de stockage ne permettent pas une distribution à la demande et entraînent un gaspillage de réactifs dû aux restes dans l'emballage.La capacité de stockage à long terme a été vérifiée en effectuant un test de durée de vie accéléré à l'aide d'un matériau PMMA usiné CNC en raison de sa légère rugosité et de sa résistance à la perméation des gaz (Figure supplémentaire S5).L'appareil de test a été rempli d'eau déminéralisée (eau déminéralisée) et d'éthanol à 70 % (réactifs volatils simulant) à 65 °C pendant 9 jours.L'eau désionisée et l'éthanol ont été stockés à l'aide d'une feuille d'aluminium pour bloquer l'accès par le haut.L'équation d'Arrhenius et l'énergie d'activation de pénétration rapportées dans la littérature50,51 ont été utilisées pour calculer l'équivalent en temps réel.Sur la fig.La figure 3b montre les résultats de perte de poids moyenne pour 5 échantillons conservés à 65°C pendant 9 jours, équivalents à 0,30 % pour l'eau déminéralisée et 0,72 % pour l'éthanol à 70 % sur 2 ans à 23°C.
Sur la fig.La figure 3c montre le test de vibration.Étant donné que la valve capillaire (CV) est la méthode de manipulation des fluides la plus populaire parmi les dispositifs POCT28,29 existants, un dispositif CV de 300 µm de large et 200 µm de profondeur a été utilisé à des fins de comparaison.On peut voir que lorsque les deux appareils restent stationnaires, le fluide dans la plateforme FAST-POCT se scelle et le fluide dans le dispositif CV se bloque en raison de l'expansion soudaine du canal, ce qui réduit les forces capillaires.Cependant, à mesure que la fréquence angulaire du vibrateur orbital augmente, le fluide contenu dans la plate-forme FAST-POCT reste scellé, mais le fluide contenu dans le dispositif CV s'écoule dans la chambre inférieure (voir également le film complémentaire S3).Ceci suggère que les charnières déformables de la plateforme FAST-POCT peuvent appliquer une forte force mécanique au module pour fermer hermétiquement le liquide dans la chambre.Cependant, dans les dispositifs CV, le liquide est retenu en raison de l'équilibre entre les phases solide, air et liquide, créant une instabilité, et les vibrations peuvent perturber l'équilibre et provoquer un comportement d'écoulement inattendu.L'avantage de la plateforme FAST-POCT est qu'elle offre une fonctionnalité fiable et évite les pannes en présence de vibrations qui se produisent habituellement lors de la livraison et de l'exploitation.
Une autre caractéristique importante de la plateforme FAST-POCT est sa diffusion à la demande, qui constitue une condition essentielle pour l'analyse quantitative.Sur la fig.3d compare la version à la demande de la plateforme FAST-POCT et du dispositif CV.De la fig.3d(iii) on voit que le dispositif FAST répond rapidement au signal de pression.Lorsque la pression était appliquée sur la plate-forme FAST-POCT, le fluide s'écoulait et lorsque la pression était relâchée, le flux s'arrêtait immédiatement (Fig. 3d (i)).Cette action s'explique par le retour élastique rapide de la charnière, qui repousse le levier contre le bloc, fermant ainsi la chambre.Cependant, le liquide a continué à s'écouler dans le dispositif CV, entraînant finalement un volume de liquide inattendu d'environ 100 µl après la libération de la pression (Figure 3d (ii) et film supplémentaire S4).Ceci peut s’expliquer par la disparition de l’effet d’épinglage capillaire lors du mouillage complet du CV après la première injection.
La capacité de gérer des liquides de mouillabilité et de viscosité variables dans le même appareil reste un défi pour les applications POCT.Une mauvaise mouillabilité peut entraîner des fuites ou d'autres comportements d'écoulement inattendus dans les canaux, et des équipements auxiliaires tels que des mélangeurs vortex, des centrifugeuses et des filtres sont souvent nécessaires pour préparer des liquides très visqueux 52 .Nous avons testé la relation entre la pression critique et les propriétés du fluide (avec une large plage de mouillabilité et de viscosité).Les résultats sont présentés dans le tableau 1 et la vidéo S5.On peut voir que des liquides de mouillabilité et de viscosité différentes peuvent être scellés dans la chambre, et lorsqu'une pression est appliquée, même des liquides d'une viscosité allant jusqu'à 5 500 cP peuvent être transférés vers la chambre adjacente, permettant ainsi de détecter des échantillons avec une viscosité élevée. viscosité (c'est-à-dire les crachats, un échantillon très visqueux utilisé pour le diagnostic des maladies respiratoires).
En combinant les dispositifs de distribution multifonctionnels ci-dessus, une large gamme de dispositifs POCT basés sur FAST peut être développée.Un exemple est présenté sur la figure 1. L'installation contient une chambre de pré-stockage, une chambre de mélange, une chambre de réaction et une chambre de déchets.Les réactifs peuvent être stockés dans la chambre de pré-stockage pendant des périodes prolongées, puis déchargés dans la chambre de mélange.Avec la bonne pression, les réactifs mélangés peuvent être transférés sélectivement vers une chambre à déchets ou une chambre de réaction.
Étant donné que la détection par PCR est la référence en matière de détection d'agents pathogènes tels que le H1N1 et le COVID-19 et qu'elle implique plusieurs étapes de réaction, nous avons utilisé la plateforme FAST-POCT pour la détection par PCR comme application.Sur la fig.La figure 4 montre le processus de test PCR utilisant la plateforme FAST-POCT.Tout d’abord, le réactif d’élution, le réactif à microbilles magnétiques, la solution de lavage A et la solution de lavage W ont été pipetés dans les chambres de pré-stockage E, M, W1 et W2, respectivement.Les étapes de l'adsorption de l'ARN sont représentées sur la fig.4a et sont les suivantes : (1) lorsque la pression P1 (=0,26 bar) est appliquée, l'échantillon se déplace dans la chambre M et est évacué dans la chambre de mélange.(2) La pression d'air P2 (= 0,12 bar) est fournie par l'orifice A relié au fond de la chambre de mélange.Bien qu'un certain nombre de méthodes de mélange aient montré leur potentiel dans le mélange de liquides sur des plates-formes POCT (par exemple le mélange en serpentine 53, le mélange aléatoire 54 et le mélange par lots 55), leur efficacité et leur efficacité de mélange ne sont toujours pas satisfaisantes.Il adopte la méthode de mélange à bulles, dans laquelle de l'air est introduit au fond de la chambre de mélange pour créer des bulles dans le liquide, après quoi le puissant vortex peut réaliser un mélange complet en quelques secondes.Des expériences de mélange de bulles ont été réalisées et les résultats sont présentés dans la Figure supplémentaire S6.On constate que lorsqu'une pression de 0,10 bar est appliquée, le mélange complet prend environ 8 secondes.En augmentant la pression à 0,20 bar, on obtient un mélange complet en 2 secondes environ.Les méthodes de calcul de l’efficacité du mélange sont présentées dans la section Méthodes.(3) Utilisez un aimant rubidium pour extraire les billes, puis mettez P3 sous pression (= 0,17 bar) via le port P pour déplacer les réactifs dans la chambre à déchets.Sur la fig.4b, c montrent les étapes de lavage pour éliminer les impuretés de l'échantillon comme suit : (1) La solution de lavage A de la chambre W1 est évacuée dans la chambre de mélange sous pression P1.(2) Effectuez ensuite le processus de mélange des bulles.(3) La solution de lavage A est transférée vers la chambre des déchets liquides et les microbilles dans la chambre de mélange sont extraites par l'aimant.Le lavage W (Fig. 4c) était similaire au lavage A (Fig. 4b).Il convient de noter que chaque étape de lavage A et W a été réalisée deux fois.La figure 4d montre les étapes d'élution pour éluer l'ARN des billes ;les étapes d'élution et d'introduction du mélange sont les mêmes que les étapes d'adsorption et de lavage d'ARN décrites ci-dessus.Lorsque les réactifs d'élution sont transférés dans la chambre de réaction PCR sous les pressions P3 et P4 (=0,23 bar), la pression critique est atteinte pour sceller le bras de la chambre de réaction PCR.De même, la pression P4 contribue également à sceller le passage vers la chambre à déchets.Ainsi, tous les réactifs d’élution ont été répartis uniformément entre les quatre chambres de réaction PCR pour lancer les réactions PCR multiplex.La procédure ci-dessus est présentée dans le film supplémentaire S6.
Lors de l’étape d’adsorption d’ARN, l’échantillon est introduit dans l’entrée M et injecté dans la chambre de mélange avec la solution de billes précédemment stockée.Après mélange et élimination des granulés, les réactifs sont distribués dans la chambre à déchets.étapes de lavage b et c, introduire divers réactifs de lavage pré-stockés dans la chambre de mélange, et après avoir mélangé et retiré les billes, transférer les réactifs vers la chambre de liquide usé.d Étape d'élution : Après introduction des réactifs d'élution, mélange et extraction des billes, les réactifs sont transférés dans la chambre de réaction PCR.Les courbes montrent le flux de travail et les paramètres associés des différentes étapes.La pression est la pression exercée à travers les chambres individuelles.Le volume est le volume de liquide dans la chambre de mélange.Toutes les barres d'échelle mesurent 1 cm.Les données brutes sont fournies sous forme de fichiers de données brutes.
Une procédure de test PCR a été réalisée et la figure supplémentaire S7 présente des profils thermiques comprenant 20 minutes de temps de transcription inverse et 60 minutes de temps de cycle thermique (95 et 60 ° C), un cycle thermique étant de 90 s (film supplémentaire S7)..FAST-POCT nécessite moins de temps pour terminer un cycle thermique (90 secondes) que la RT-PCR conventionnelle (180 secondes pour un cycle thermique).Cela peut s’expliquer par le rapport surface/volume élevé et la faible inertie thermique de la chambre de réaction micro-PCR.La surface de la chambre est de 96,6 mm2 et le volume de la chambre est de 25 mm3, ce qui rend le rapport surface/volume d'environ 3,86.Comme le montre la Figure supplémentaire S10, la zone de test PCR de notre plate-forme présente une rainure sur le panneau arrière, ce qui donne au fond de la chambre PCR une épaisseur de 200 µm.Un coussinet élastique thermoconducteur est fixé à la surface chauffante du régulateur de température, assurant un contact étroit avec l'arrière de la boîte de test.Cela réduit l’inertie thermique de la plateforme et améliore l’efficacité du chauffage/refroidissement.Pendant le cycle thermique, la paraffine incorporée dans la plate-forme fond et s'écoule dans la chambre de réaction PCR, agissant comme un agent d'étanchéité pour empêcher l'évaporation des réactifs et la contamination de l'environnement (voir le film complémentaire S8).
Tous les processus de détection PCR décrits ci-dessus ont été entièrement automatisés à l'aide d'un instrument FAST-POCT sur mesure, composé d'une unité de contrôle de pression programmée, d'une unité d'extraction magnétique, d'une unité de contrôle de température et d'une unité de capture et de traitement du signal fluorescent.Il convient de noter que nous avons utilisé la plate-forme FAST-POCT pour l'isolement de l'ARN, puis utilisé les échantillons d'ARN extraits pour les réactions PCR en utilisant le système FAST-POCT et le système PCR de bureau à des fins de comparaison.Les résultats étaient presque les mêmes que ceux présentés dans la Figure supplémentaire S8.L'opérateur effectue une tâche simple : introduit l'échantillon dans la chambre M et insère la plateforme dans l'instrument.Les résultats des tests quantitatifs sont disponibles en 82 minutes environ.Des informations détaillées sur les outils FAST-POCT sont disponibles dans la figure supplémentaire.C9, C10 et C11.
La grippe causée par les virus grippaux A (IAV), B (IBV), C (ICV) et D (IDV) est un phénomène mondial courant.Parmi ceux-ci, l'IAV et l'IBV sont responsables des cas les plus graves et des épidémies saisonnières, infectant 5 à 15 % de la population mondiale, provoquant 3 à 5 millions de cas graves et causant entre 290 000 et 650 000 décès par an.Maladies respiratoires56,57.Un diagnostic précoce de l'IAV et de l'IB est essentiel pour réduire la morbidité et le fardeau économique associé.Parmi les techniques de diagnostic disponibles, la réaction en chaîne par polymérase par transcriptase inverse (RT-PCR) est considérée comme la plus sensible, spécifique et précise (> 99 %)58,59.Parmi les techniques de diagnostic disponibles, la réaction en chaîne par polymérase par transcriptase inverse (RT-PCR) est considérée comme la plus sensible, spécifique et précise (> 99 %)58,59.Среди доступных диагностических методов полимеразная цепная реакция собратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) считается наиболее чувствительной, spécifique et précis (> 99%)58,59.Parmi les méthodes de diagnostic disponibles, la réaction en chaîne par polymérase par transcriptase inverse (RT-PCR) est considérée comme la plus sensible, spécifique et précise (> 99 %)58,59. Pour les méthodes de diagnostic détaillées, la réaction de la transcription avec la transcription officielle (ОТ-ПЦР) est établie, eцифичной и точной (>99%)58,59.Parmi les méthodes de diagnostic disponibles, la réaction en chaîne par polymérase par transcriptase inverse (RT-PCR) est considérée comme la plus sensible, spécifique et précise (> 99 %)58,59.Cependant, les méthodes RT-PCR traditionnelles nécessitent un pipetage, un mélange, une distribution et un transfert répétés du liquide, ce qui limite leur utilisation par les professionnels dans des contextes aux ressources limitées.Ici, la plateforme FAST-POCT a été utilisée pour la détection PCR de l'IAV et de l'IBV, respectivement, afin d'obtenir leur limite inférieure de détection (LOD).De plus, l’IAV et l’IBV ont été multiplexés pour distinguer différents pathotypes d’une espèce à l’autre, offrant ainsi une plateforme prometteuse pour l’analyse génétique et la capacité de traiter la maladie avec précision.
Sur la fig.La figure 5a montre les résultats du test PCR HAV utilisant 150 µl d'ARN viral purifié comme échantillon.Sur la fig.La figure 5a(i) montre qu'à une concentration de HAV de 106 copies/ml, l'intensité de fluorescence (ΔRn) peut atteindre 0,830, et lorsque la concentration est réduite à 102 copies/ml, ΔRn peut encore atteindre 0,365, ce qui correspond à une valeur supérieure à celle-ci. du groupe témoin négatif vide (0,002), environ 100 fois plus élevé.Pour la quantification basée sur six expériences indépendantes, une courbe d'étalonnage linéaire a été générée entre la concentration logarithmique et le seuil de cycle (Ct) de l'IAV (Fig. 5a (ii)), R2 = 0,993, allant de 102 à 106 copies/mL.les résultats sont en bon accord avec les méthodes RT-PCR conventionnelles.Sur la fig.5a (iii) montre des images fluorescentes des résultats de tests après 40 cycles de la plateforme FAST-POCT.Nous avons constaté que la plateforme FAST-POCT peut détecter le VHA à un niveau aussi bas que 102 copies/mL.Cependant, la méthode traditionnelle n’a pas de valeur Ct à 102 copies/mL, ce qui en fait une LOD d’environ 103 copies/mL.Nous avons émis l’hypothèse que cela pourrait être dû à la grande efficacité du mélange des bulles.Des expériences de test PCR ont été réalisées sur de l'ARN IAV purifié pour évaluer diverses méthodes de mélange, y compris le mélange par agitation (même méthode de mélange que dans le cadre d'une opération RT-PCR conventionnelle), le mélange en flacon (cette méthode, 3 s à 0,12 bar) et l'absence de mélange en tant que groupe témoin. ..Les résultats peuvent être trouvés dans la figure supplémentaire S12.On constate qu’à une concentration d’ARN plus élevée (106 copies/mL), les valeurs Ct des différentes méthodes de mélange sont quasiment les mêmes que pour le mélange à bulles.Lorsque la concentration d'ARN est tombée à 102 copies/mL, le mélange shake et les contrôles n'avaient aucune valeur Ct, tandis que la méthode de mélange à bulles donnait toujours une valeur Ct de 36,9, ce qui était inférieur au seuil Ct de 38. Les résultats montrent une caractéristique de mélange dominante. vésicules, ce qui a également été démontré dans d'autres publications, ce qui peut également expliquer pourquoi la sensibilité de la plateforme FAST-POCT est légèrement supérieure à celle de la RT-PCR classique.Sur la fig.La figure 5b montre les résultats de l'analyse PCR d'échantillons d'ARN IBV purifiés allant de 101 à 106 copies/ml.Les résultats étaient similaires à ceux du test IAV, atteignant un R2 = 0,994 et une LOD de 102 copies/mL.
une analyse PCR du virus de la grippe A (IAV) avec des concentrations d'IAV allant de 106 à 101 copies/mL en utilisant le tampon TE comme contrôle négatif (NC).(i) Courbe de fluorescence en temps réel.(ii) Courbe d'étalonnage linéaire entre la concentration logarithmique d'ARN IAV et le seuil de cycle (Ct) pour les méthodes de test FAST et conventionnelles.(iii) Image fluorescente IAV FAST-POCT après 40 cycles.b, détection PCR du virus de la grippe B (IBV) avec (i) spectre de fluorescence en temps réel.(ii) Courbe d'étalonnage linéaire et (iii) Image de fluorescence FAST-POCT IBV après 40 cycles.La limite inférieure de détection (LOD) pour l'IAV et l'IBV en utilisant la plateforme FAST-POCT était de 102 copies/mL, ce qui est inférieur aux méthodes conventionnelles (103 copies/mL).c Résultats des tests multiplex pour IAV et IBV.GAPDH a été utilisé comme contrôle positif et le tampon TE a été utilisé comme contrôle négatif pour éviter une éventuelle contamination et une amplification de fond.Quatre types d'échantillons différents peuvent être distingués : (1) échantillons négatifs uniquement GAPDH (« IAV-/IBV- » );(2) infection par IAV (« IAV+/IBV- ») par IAV et GAPDH ;(3) infection par l'IBV (« IAV-/IBV+ ») par IBV et GAPDH ;(4) Infection IAV/IBV (« IAV+/IBV+ ») par IAV, IBV et GAPDH.La ligne pointillée représente la ligne de seuil.n = 6 expériences biologiquement indépendantes ont été réalisées, les données sont présentées sous forme de ± écart type.Les données brutes sont présentées sous forme de fichiers de données brutes.
Sur la fig.La figure 5c montre les résultats du test de multiplexage pour IAV/IBV.Ici, le lysat viral a été utilisé comme solution échantillon à la place de l'ARN purifié, et quatre amorces pour IAV, IBV, GAPDH (contrôle positif) et le tampon TE (contrôle négatif) ont été ajoutées à quatre chambres de réaction différentes de la plateforme FAST-POCT.Des contrôles positifs et négatifs sont utilisés ici pour éviter une éventuelle contamination et une amélioration du fond.Les tests ont été divisés en quatre groupes : (1) échantillons négatifs pour GAPDH (« IAV-/IBV- » );(2) infecté par IAV (« IAV+/IBV- ») versus IAV et GAPDH ;(3) IBV-.infectés (« IAV- ») -/IBV+ ») IBV et GAPDH ;(4) Infection IAV/IBV (« IAV+/IBV+ ») par IAV, IBV et GAPDH.Sur la fig.La figure 5c montre que lorsque des échantillons négatifs ont été appliqués, l'intensité de fluorescence ΔRn de la chambre de contrôle positif était de 0,860 et l'intensité de fluorescence ΔRn de l'IAV et de l'IBV était similaire à celle du contrôle négatif (0,002).Pour les groupes IAV+/IBV-, IAV-/IBV+ et IAV+/IBV+, les caméras IAV/GAPDH, IBV/GAPDH et IAV/IBV/GAPDH ont montré respectivement une intensité de fluorescence significative, tandis que les autres caméras ont même montré une intensité de fluorescence en arrière-plan. niveau de 40 après cyclage thermique.À partir des tests ci-dessus, la plateforme FAST-POCT a montré une spécificité exceptionnelle et nous a permis de pathotyper simultanément différents virus de la grippe.
Pour valider l'applicabilité clinique de FAST-POCT, nous avons testé 36 échantillons cliniques (échantillons sur écouvillon nasal) provenant de patients IB (n = 18) et de témoins non IB (n = 18) (Figure 6a).Les informations sur les patients sont présentées dans le tableau supplémentaire 3. Le statut d'infection par l'IB a été confirmé de manière indépendante et le protocole de l'étude a été approuvé par le premier hôpital affilié à l'université du Zhejiang (Hangzhou, Zhejiang).Chaque échantillon de patients a été divisé en deux catégories.L’un a été traité à l’aide de FAST-POCT et l’autre à l’aide d’un système PCR de bureau (SLAN-96P, Chine).Les deux tests utilisent les mêmes kits de purification et de détection.Sur la fig.La figure 6b montre les résultats de FAST-POCT et de PCR à transcription inverse conventionnelle (RT-PCR).Nous avons comparé l'intensité de fluorescence (FAST-POCT) avec -log2(Ct), où Ct est le seuil de cycle pour la RT-PCR conventionnelle.Il y avait un bon accord entre les deux méthodes.FAST-POCT et RT-PCR ont montré une forte corrélation positive avec une valeur du rapport de Pearson (r) de 0,90 (Figure 6b).Nous avons ensuite évalué la précision diagnostique de FAST-POCT.Les distributions d'intensité de fluorescence (FL) pour les échantillons positifs et négatifs ont été fournies en tant que mesure analytique indépendante (Fig. 6c).Les valeurs de FL étaient significativement plus élevées chez les patients IB que chez les témoins (****P = 3,31 × 10-19 ; test t bilatéral) (Fig. 6d).Ensuite, les courbes des caractéristiques de fonctionnement du récepteur IBV (ROC) ont été tracées.Nous avons constaté que la précision du diagnostic était très bonne, avec une aire sous la courbe de 1 (Fig. 6e).Veuillez noter qu'en raison de la commande obligatoire de masques en Chine en raison du COVID-19 à partir de 2020, nous n'avons pas identifié de patients atteints de MII, donc tous les échantillons cliniques positifs (c'est-à-dire les échantillons sur écouvillon nasal) concernaient uniquement l'IBV.
Conception d'études cliniques.Un total de 36 échantillons, dont 18 échantillons de patients et 18 contrôles non grippaux, ont été analysés à l'aide de la plateforme FAST-POCT et de la RT-PCR conventionnelle.b Évaluer la cohérence analytique entre la PCR FAST-POCT et la RT-PCR conventionnelle.Les résultats étaient positivement corrélés (Pearson r = 0,90).c Niveaux d'intensité de fluorescence chez 18 patients IB et 18 témoins.d Chez les patients IB (+), les valeurs FL étaient significativement plus élevées que dans le groupe témoin (-) (****P = 3,31 × 10-19 ; test t bilatéral ; n = 36).Pour chaque parcelle carrée, le marqueur noir au centre représente la médiane, et les lignes inférieure et supérieure de la boîte représentent respectivement les 25e et 75e centiles.Les moustaches s'étendent jusqu'aux points de données minimum et maximum, qui ne sont pas considérés comme des valeurs aberrantes.la courbe ROC.La ligne pointillée d représente la valeur seuil estimée à partir de l'analyse ROC.L'AUC de l'IBV est de 1. Les données brutes sont fournies sous forme de fichiers de données brutes.
Dans cet article, nous présentons FAST, qui possède les caractéristiques requises pour un POCT idéal.Les avantages de notre technologie incluent : (1) Dosage polyvalent (cascade, simultané, séquentiel et sélectif), libération à la demande (libération rapide et proportionnelle de la pression appliquée) et fonctionnement fiable (vibration à 150 degrés) (2) stockage à long terme (2 ans de tests accélérés, perte de poids d'environ 0,3 %) ;(3) la capacité de travailler avec des liquides avec une large plage de mouillabilité et de viscosité (viscosité jusqu'à 5 500 cP) ;(4) Économique (le coût matériel estimé du dispositif FAST-POCT PCR est d'environ 1 $ US).En combinant des distributeurs multifonctionnels, une plateforme FAST-POCT intégrée pour la détection PCR des virus grippaux A et B a été démontrée et appliquée.FAST-POCT ne prend que 82 minutes.Les tests cliniques avec 36 échantillons sur écouvillon nasal ont montré une bonne concordance de l'intensité de fluorescence avec la RT-PCR standard (coefficients de Pearson > 0,9).Les tests cliniques avec 36 échantillons sur écouvillon nasal ont montré une bonne concordance de l'intensité de fluorescence avec la RT-PCR standard (coefficients de Pearson > 0,9).Tests cliniques avec 36 masques de nettoyage standard de l'organisme ициенты Пирсона > 0,9).Les tests cliniques avec 36 échantillons d'écouvillons nasaux ont montré un bon accord avec l'intensité de fluorescence de la RT-PCR standard (coefficients de Pearson > 0,9).RT-PCR 36 méthodes d'administration de la fluorescence selon les normes standard de l'O.T.-P. фициент Пирсона > 0,9).Les tests cliniques de 36 échantillons sur écouvillon nasal ont montré un bon accord d'intensité de fluorescence avec la RT-PCR standard (coefficient de Pearson > 0,9).Parallèlement à ces travaux, diverses méthodes biochimiques émergentes (par exemple, le cycle thermique du plasma, les tests immunologiques sans amplification et les tests de fonctionnalisation des nanocorps) ont montré leur potentiel en POCT.Cependant, en raison de l'absence d'une plate-forme POCT entièrement intégrée et robuste, ces méthodes nécessitent inévitablement des procédures de prétraitement distinctes (par exemple, l'isolement de l'ARN44, l'incubation45 et le lavage46), qui complètent les travaux actuels avec ces méthodes pour mettre en œuvre des fonctions POCT avancées avec les paramètres requis.performances de récupération en réponse à la sortie.Dans ce travail, bien que la pompe à air utilisée pour activer la valve FAST soit suffisamment petite pour être intégrée dans un instrument de table (Fig. S9, S10), elle consomme néanmoins une énergie importante et génère du bruit.En principe, les pompes pneumatiques de plus petit format peuvent être remplacées par d'autres moyens, tels que l'utilisation d'une force électromagnétique ou d'un actionnement au doigt.D'autres améliorations pourraient inclure, par exemple, l'adaptation de kits pour des analyses biochimiques différentes et spécifiques, en utilisant de nouvelles méthodes de détection qui ne nécessitent pas de systèmes de chauffage/refroidissement, fournissant ainsi une plateforme POCT sans outil pour les applications PCR.Nous pensons qu'étant donné que la plateforme FAST offre un moyen de manipuler des liquides, nous pensons que la technologie FAST proposée présente le potentiel de créer une plateforme commune non seulement pour les tests biomédicaux, mais également pour la surveillance environnementale, les tests de qualité alimentaire, la synthèse de matériaux et de médicaments. ..
La collecte et l'utilisation d'échantillons nasaux humains sur écouvillon ont été approuvées par le comité d'éthique du premier hôpital affilié à l'université du Zhejiang (IIT20220330B).36 échantillons par écouvillonnage nasal ont été collectés, impliquant 16 adultes de < 30 ans, 7 adultes de > 40 ans et 19 hommes et 17 femmes.36 échantillons par écouvillonnage nasal ont été collectés, impliquant 16 adultes de < 30 ans, 7 adultes de > 40 ans et 19 hommes et 17 femmes.Il s'agit de 36 hommes de sexe masculin, pour des enfants de 16 ans < 30 ans, 7 ans de 40 ans, 19 ans et 17 ans .Trente-six échantillons sur écouvillon nasal ont été prélevés auprès de 16 adultes de < 30 ans, 7 adultes de plus de 40 ans, 19 hommes et 17 femmes..Les données démographiques sont présentées dans le tableau supplémentaire 3. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants.Tous les participants étaient soupçonnés d'avoir la grippe et ont été testés volontairement sans compensation.
La base et le couvercle FAST sont fabriqués en acide polylactique (PLA) et imprimés par l'imprimante 3D Ender 3 Pro (Shenzhen Transcend 3D Technology Co., Ltd.).Le ruban adhésif double face a été acheté auprès d'Adhesives Research, Inc. Modèle 90880. Un film PET de 100 µm d'épaisseur a été acheté auprès de McMaster-Carr.L'adhésif et le film PET ont été découpés à l'aide du cutter Silhouette Cameo 2 de Silhouette America, Inc. Le film élastique est fabriqué en matériau PDMS par moulage par injection.Tout d’abord, un cadre en PET de 200 µm d’épaisseur a été découpé à l’aide d’un système laser et collé sur une feuille de PMMA de 3 mm d’épaisseur à l’aide d’un ruban adhésif double face de 100 µm.Le précurseur du PDMS (Sylgard 184 ; partie A : partie B = 10 : 1, Dow Corning) a ensuite été versé dans le moule et une tige de verre a été utilisée pour éliminer l'excès de PDMS.Après durcissement à 70°C pendant 3 heures, le film PDMS de 300 µm d'épaisseur a pu être décollé du moule.
Les photos destinées à une distribution polyvalente, une publication à la demande et des performances fiables sont prises avec un appareil photo haute vitesse (Sony AX700 1 000 ips).L'agitateur orbital utilisé dans le test de fiabilité a été acheté auprès de SCILOGEX (SCI-O180).La pression de l'air est générée par un compresseur d'air et plusieurs régulateurs de pression numériques de précision sont utilisés pour ajuster la valeur de pression.Le processus de test du comportement d’écoulement est le suivant.Une quantité prédéterminée de fluide a été injectée dans le dispositif de test et une caméra haute vitesse a été utilisée pour enregistrer le comportement de l'écoulement.Des images fixes ont ensuite été prises à partir de vidéos du comportement de l'écoulement à des heures fixes, et la surface restante a été calculée à l'aide du logiciel Image-Pro Plus, qui a ensuite été multipliée par la profondeur de la caméra pour calculer le volume.Des détails sur le système de test du comportement d'écoulement peuvent être trouvés dans la Figure supplémentaire S4.
Injecter 50 µl de microbilles et 100 µl d’eau déminéralisée dans le dispositif de mélange du flacon.Des photographies de performances mixtes ont été prises avec une caméra haute vitesse toutes les 0,1 seconde à des pressions de 0,1 bar, 0,15 bar et 0,2 bar.Les informations sur les pixels pendant le processus de fusion peuvent être obtenues à partir de ces images à l'aide d'un logiciel de traitement de photos (Photoshop CS6).Et l’efficacité du mélange peut être obtenue avec l’équation 53 suivante.
où M est l'efficacité du mélange, N est le nombre total de pixels de l'échantillon et ci et \(\bar{c}\) sont les concentrations normalisées et attendues.L'efficacité du mélange varie de 0 (0 %, non mélangé) à 1 (100 %, entièrement mélangé).Les résultats sont présentés dans la Figure supplémentaire S6.
Kit RT-PCR en temps réel pour IAV et IBV, comprenant des échantillons d'ARN IAV et IBV (cat. n° RR-0051-02/RR-0052-02, Liferiver, Chine), tampon Tris-EDTA (tampon TE n° B541019 , Sangon Biotech, Chine), le kit de purification d'ARN de contrôle positif (réf. Z-ME-0010, Liferiver, Chine) et la solution GAPDH (réf. M591101, Sangon Biotech, Chine) sont disponibles dans le commerce.Le kit de purification d'ARN comprend un tampon de liaison, un lavage A, un lavage W, un éluant, des microbilles magnétiques et un support acrylique.Les kits RT-PCR en temps réel IAV et IBV comprennent un mélange de détection PCR d'acide nucléique IFVA et une enzyme RT-PCR.Ajouter 6 µl d’AcrylCarrier et 20 µl de billes magnétiques à 500 µl de solution tampon de liaison, bien agiter puis préparer la solution de billes.Ajouter 21 ml d'éthanol aux lavages A et W, bien agiter pour obtenir des solutions de lavages A et W, respectivement.Ensuite, 18 µl de mélange PCR fluorescent avec l'acide nucléique IFVA et 1 µl d'enzyme RT-PCR ont été ajoutés à 1 µl de solution TE, secoués et centrifugés pendant plusieurs secondes, obtenant 20 µl d'amorces IAV et IBV.
Suivez la procédure de purification d’ARN suivante : (1) Adsorption d’ARN.Pipeter 526 µl de la solution de culot dans un tube à centrifuger de 1,5 ml et ajouter 150 µl d’échantillon, puis agiter manuellement le tube de haut en bas 10 fois.Transférer 676 µl du mélange dans la colonne d’affinité et centrifuger à 1,88 x 104 g pendant 60 secondes.Les drains suivants sont ensuite jetés.(2) La première étape du lavage.Ajouter 500 µl de solution de lavage A à la colonne d’affinité, centrifuger à 1,88 x 104 g pendant 40 s et jeter la solution usée.Ce processus de lavage a été répété deux fois.(3) la deuxième étape du lavage.Ajouter 500 µl de solution de lavage W à la colonne d’affinité, centrifuger à 1,88 × 104 g pendant 15 s et jeter la solution usée.Ce processus de lavage a été répété deux fois.(4) Élution.Ajouter 200 µl d’éluat à la colonne d’affinité et centrifuger à 1,88 x 104 g pendant 2 min.(5) RT-PCR : L'éluat a été injecté dans 20 µl de solution d'amorce dans un tube PCR, puis le tube a été placé dans un appareil de test PCR en temps réel (SLAN-96P) pour réaliser le processus RT-PCR.L’ensemble du processus de détection prend environ 140 minutes (20 minutes pour la purification de l’ARN et 120 minutes pour la détection PCR).
526 µl de solution de billes, 1 000 µl de solution de lavage A, 1 000 µl de solution de lavage W, 200 µl d'éluat et 20 µl de solution d'amorce ont été préalablement ajoutés et stockés dans les chambres M, W1, W2, E et les chambres de détection PCR.Assemblage de la plateforme.Ensuite, 150 µl de l'échantillon ont été pipetés dans la chambre M et la plate-forme FAST-POCT a été insérée dans l'instrument de test illustré à la Figure supplémentaire S9.Après environ 82 minutes, les résultats du test étaient disponibles.
Sauf indication contraire, tous les résultats des tests sont présentés sous forme de moyenne ± écart-type après un minimum de six répétitions en utilisant uniquement la plateforme FAST-POCT et des échantillons biologiquement indépendants.Aucune donnée n'a été exclue de l'analyse.Les expériences ne sont pas aléatoires.Les chercheurs n’étaient pas aveugles aux tâches de groupe au cours de l’expérience.
Pour plus d’informations sur la conception de l’étude, consultez le résumé du Nature Research Report lié à cet article.
Les données étayant les résultats de cette étude sont disponibles dans les informations supplémentaires.Cet article fournit les données originales.
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